Трихостатин

Трихостатин

Академический редактор: По-Лин Куо

Было показано, что лапатиниб, двойной ингибитор тирозинкиназы EGFR / HER2, повышает выживаемость пациентов с прогрессирующим HER2-положительным раком молочной железы. Тем не менее было показано, что активность лапатиниба в неактивной активности при индуцировании экспрессии EGFR без активности тирозинкиназы делает HER2-негативные клетки рака молочной железы более метастатическими, что указывает на ограничение терапевтической эффективности этого двойного ингибитора в гетерогенных опухолях HER2. Таким образом, нацеливание на экспрессию EGFR может быть осуществимым подходом для улучшения противоопухолевой эффективности терапии на основе лапатиниба. Ранее сообщалось о ингибировании HDAC, чтобы эпигенетически подавить экспрессию EGFR белка. Однако в этом исследовании наши данные показали, что лечение ингибиторами HDAC трихостатина A (TSA), но не субероиланилидной гидроксамовой кислоты (SAHA) или HDAC siRNA, может ослаблять как экспрессию белков, так и мРНК EGFR при лечении тройного отрицательного рака молочной железы, обработанного лапатинибом клеток, предполагая, что TSA может подавлять экспрессию EGFR независимо от ингибирования HDAC. Тем не менее TSA снижает активность EGFR 3’UTR и индуцирует экспрессию гена microRNA-7, известной микроРНК, нацеленной на EGFR. Кроме того, лечение ингибитором микроРНК-7 ослабляло TSA-опосредованное подавление EGFR. Эти результаты показывают, что TSA индуцировала экспрессию микроРНК-7 для снижения EGFR-экспрессии в HDAC-независимом режиме.

Усиление и сверхэкспрессия рецепторной тирозинкиназы HER2 (также называемой ErbB2), обнаруженной у 20-30% рака молочной железы, связаны с плохим клиническим результатом пациента, включая метастазы в лимфатические узлы, более короткую выживаемость и более короткое время повторения [1, 2 ]. Активация HER2 инициирует каскад сигнальной трансдукции, включая пути PI3K / Akt и MAPK, для опосредования клеточного роста и выживаемости [3]. Дисрегуляция этих сигнальных путей от сверхэкспрессированного HER2 вызывает множественные транскрипции генов, связанные с неопластической трансформацией, инициацией, клеточной иммортализацией и прогрессированием опухоли [4]. Таким образом, нацеливание на активность тирозинкиназы этого рецептора рассматривается как перспективная терапевтическая стратегия для лечения пациентов с раком молочной железы с гиперэкспрессией HER2 [3, 5].

Lapatinib (Tykerb, GW-572016), двойной ингибитор тирозинкиназы рецепторов рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) и HER2, был использован для продвинутых пациентов с HER2-положительным раком молочной железы, которые не прошли химиотерапию или терапию HER2-мишенью с моноклональным антителом трастузумабом [6, 7]. Хотя большинство клинических преимуществ лечения на основе лапатиниба наблюдалось у пациентов с HER2-положительным раком молочной железы, все еще существует несколько клинических испытаний лапатиниба у HER2-отрицательных пациентов из-за активности ингибирования EGFR [8-16]. Экспрессия EGFR была обнаружена в до 80% случаев тройного отрицательного (HER2 / ER / PgR-отрицательного) рака молочной железы, и таргетинг на EGFR, таким образом, также рассматривался как потенциальная терапевтическая стратегия для такого заболевания [17-20]. При использовании в качестве монотерапии или в сочетании с химиотерапией клинические преимущества лапатиниба при тройном отрицательном или HER2-отрицательном раке молочной железы были испытаны во время испытаний II фазы [21, 22]. Тем не менее, никакая значительная выгода от добавления лапатиниба к паклитакселу не была обнаружена при общих HER2-негативных заболеваниях, и, как ни удивительно, худший клинический результат с более короткой средой безрецидивной выживаемости был обнаружен даже у пациентов с раком молочной железы с тройным отрицательным или HER2-отрицательным / PgR-негативные опухоли [14]. Наше предыдущее исследование также выявило неактивную активность лапатиниба в повышении агрессивности тройных отрицательных клеточных линий к подмышечным лимфатическим узлам и легким у мышей с ортотопическими опухолями-ксенотрансплантатами [23]. Было показано, что повышение уровня EGFR посредством подавления микроРНК-7 [24] способствует увеличению подвижности клеток, усиленных лапатинибом. Поэтому нацеливание на экспрессию белка EGFR было бы эффективной стратегией для предотвращения метастазирования клеток, вызванных лапатинибом.

Гистондезацетилазы (HDAC), которые регулируют транскрипции генов путем удаления ацетильных групп из лизиновых остатков гистонов или белков транскрипционного фактора, часто были сверхэкспрессированы во множестве типов рака [25]. Более высокая экспрессия нескольких подтипов HDAC была связана с усиленной миграцией и инвазией клеток рака молочной железы [26-28]. Прометастатические эффекты HDACs связаны с транскрипционной регуляцией EGFR [29]. Также было показано, что ингибиторы HDAC обладают противоопухолевой активностью [30] и антидиабетической активностью роста почек [31] и усиливают противораковую активность ингибитора тирозинкиназы EGFR гефитиниба [29]. Но молекулярные механизмы экспрессии EGFR, снижающие ингибитор HDAC, остаются в значительной степени неизвестными. Таким образом, эти открытые вопросы побудили нас исследовать, ингибиторы HDAC подавляют экспрессию EGFR, индуцированную лапатинибом.

Читайте также:  Тираминовый синдром

В этом исследовании мы неожиданно обнаружили, что ингибитор HDAC trichostatin A (TSA), но не субероиланилид-гидроксамовая кислота (SAHA), подавляет уровень белка EGFR независимо от ингибирования HDAC в клетках рака молочной железы, обработанных лапатинибом. Независимо от активности ингибирования HDAC, TSA индуцировала микроРНК-7 для целевого EGFR 3’UTR. Эти результаты обнаружили внецелевую активность TSA в регуляции экспрессии микроРНК.

Клеточные линии рака молочной железы человека MDA-MB-231 и их производные культивировали в DMEM / F-12 с 10% фетальной бычьей сывороткой. Выбранные лапатинибом раковые клетки были установлены путем отбора с постепенным увеличением концентрации лапатиниба в течение двух месяцев. Установленные устойчивые линии раковых клеток тестировали на их нечувствительность к соответствующему лекарственному средству и культивировали в присутствии 1 мкМ лапатиниба. Клоны HDAC siRNA были приобретены у Dharmacon. Клетки трансфецировали оливином siRNA (5′-GAUGCUGAACCAUGCACCUTT-3 ‘) и (5′-CACCAUGCAGAUCAUUCAATT-3′) для целевого HDAC3 и HDAC7 соответственно или с неигровой контрольной сиРНК (5’-UGGUUUACAUGUCGACUAA-3 ‘) с DharmaFECT 1 (Dharmacon) в течение 72 часов для дальнейших экспериментов. Анти-EGFR (SC-03), анти-HDAC3, анти-HDAC7 и антиактин-антитела от Santa Cruz использовали для анализа вестерн-блоттинга. Ингибиторы HDAC (TSA и SAHA), протеасомные ингибиторы и лизосомные ингибиторы были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США).

Были получены полные клеточные лизаты и подвергнуты SDS-PAGE с использованием 7,5% бегущих гелей. Белки переносили в мембрану из поливинилидендифторида (PVDF), которую затем инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа с 0,1% молоком в TTBS (50 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 0,15 М NaCl и 0,05% Твин-20) , в течение 1 часа со специфическими первичными антителами и в течение 30 минут с HRP-меченым антителом против кроликов. После каждой инкубации мембрану интенсивно промывали TTBS. Иммунореактивные полосы детектируют с использованием ECL-детектирующего реагента и Hyperfilm ECL (Amersham International).

Общая РНК была экстрагирована с использованием реагента TRIzol (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя, как описано ранее [32]. Для микроРНК каждая RT-реакция содержала 2 мкг РНК, 50 нмоль / л корневого RT-праймера, 0,25 ммоль / л каждого дезоксинуклеотидтрифосфата, 50 единиц обратной транскриптазы вируса мышиного лейкоза Молони (Invitrogen), 1 × RT-буфер , 10 ммоль / л DTT и 4 единицы ингибитора РНКазы. Праймер RT для штоковой петли для hsa-miR-7 был разработан в соответствии со зрелой миРНК-последовательностью (Sanger Center miRNA Registry, http://www.mirbase.org/). Последовательности RT-праймеров следующие: праймер hsa-miR-7 RT, 5′-GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAACACAACA-3 ‘; U48 RT, 5’-GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAACTCAGCG-3 ‘. Реакция ПЦР в реальном времени содержала 0,5 мкмоль / л каждого прямого и обратного праймера, 0,1 мкмоль / л универсального зонда ProbeLibrary № 21 (Roche), 1 × LightCycler TaqMan Master и 2 мкл кДНК с использованием Roche LightCycler 480 Real -режимная ПЦР-система. В качестве внутреннего контроля использовалась небольшая ядерная РНК U48. Последовательности передних праймеров были следующими: hsa-miR-7, 5’-GCGGCGTGGAAGACTAGTGAT-3 ‘; U48, 5’-CGGCGGTAACTCTGAGTGTGT-3 ‘. Обратным праймером для всех вышеуказанных наборов генов был 5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3 ‘. Для мРНК EGFR и актина 1 мкг общей РНК подвергали RT с использованием олиго-dT-праймера с использованием набора обратной транскриптазы (Invitrogen). Равные количества кДНК (2 мкл) подвергали ПЦР и амплифицировали с помощью 30 циклов, используя следующие праймеры: EGFR, вперед 5’-GTTGATATCATGCGACCCTCCGGGACG-3 ‘и обратный 5′-GGTTCTAGATCATGCTCCAATAAATTC-3′; HDAC3, вперед 5’-ATGAAGTCGGGGCAGAGAGTG-3 ‘и обратный 5′-CACAATGCACGTGGGTTGG-3′; HDAC7, вперед 5’-TCTGTCCCGGGCTCAGTCTT-3 ‘; Actin, форвард 5’-CTGGAACGGTGAAGGTGACA-3 ‘и обратный 5′-AAGGGACTTCCTGTAACAATGCA-3’. Продукты ПЦР подвергали электрофорезу в 1,2% агарозном геле и визуализировали окрашиванием этидиумбромидом. Реакции ПЦР в реальном времени, содержащие 0,3 мкл кДНК, 0,3 мкл прямого и обратного праймеров, 5 мкл 2X SYBR Green (Roche) и 1,4 мкл дистиллированной воды проводили с помощью PCR-системы Roche LightCycler 480 в реальном времени.

Анализ проводили в соответствии с инструкцией по изготовлению (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA). Ядерные экстракты готовили и подвергали иммунопреципитации специфическими антителами HDAC. Реакцию деацетилирования субстрата инициировали путем смешивания меченых флуоресценцией ацетилированного пептида с HDAC-содержащим ядерным экстрактом или иммунопреципитатами в течение заданного периода времени. Затем проявитель добавляли к реакции для расщепления полученного деацетилированного флуоресцентного меченого пептида и прекращения активности HDAC, в результате чего получали хемилюминесцентное соединение. Затем энхансер добавляли для визуализации хемилюминесцентного продукта.

Читайте также:  Томография ноги

Ген репортер люциферазы, содержащий полноразмерную 3′-нетранслируемую область (UTR) человеческого EGFR-гена, был подарком от доктора Кита Джайлса (Западно-австралийский институт медицинских исследований). Клетки с 60-80% слияния трансфицировали 0,5 мкг плазмиды EGFR-3’UTR люциферазы с использованием трансфекционного реагента TransIT-2020 в соответствии с инструкцией производителя. Через 24 ч трансфекции клетки обрабатывали TSA в течение еще 24 часов, а общий лизат собирали и подвергали анализу активности люциферазы. Активность люциферазы была нормирована на β-gal. Для трансфекции siRNA / microRNA клетки с 60-80% слияния трансфицировали различными siRNA / microRNA с использованием реагента трансфекции DharmaFECT 1. Клетки собирали в указанные моменты времени и подвергали дальнейшему эксперименту.

Трихостатин А
Химическое соединение
ИЮПАК 7-[4-(dimethylamino)phenyl]-N-hydroxy-4,6-dimethyl-7-oxohepta-2,4-dienamide
Брутто-формула C17H22N2O3
Молярная масса 302.37 г/моль
CAS 58880-19-6
PubChem 444732
DrugBank 04297

Трихостатин А — А IUPAC_name = 7-[4-(dimethylamino)phenyl]-N-hydroxy-4,6-dimethyl-7-oxohepta-2,4-dienamide

Трихостатин А (TSA) является органическим соединением, которое обладает противогрибковой активностью и селективно ингибирует класс I и II семейства ферментов гистондеацетилаз (HDAC) млекопитающих, но не влияет на III класс этих ферментов под названием Sirtuins [1] . TSA ингибирует цикл деления эукариотической клетки в начальной стадии роста. Трихостатин может быть использован для изменения экспрессию генов путем удаления ацетильных групп у ядерных белков — гистонов, активируя гидролитические ферменты гистондезацетилазы (HDAC) и облегчая доступ и проникновение факторов транскрипции к молекулам ДНК внутри хроматина. TSA является членом более крупного класса ингибиторов гистондеацетилазы (HDIs или HDACIs), которые имеют широкий спектр эпигенетической деятельности. Считают, что TSA имеет некоторый потенциал в качестве лекарственного средства против рака [2] . Одним из предложенных механизмов является то, что TSA способствует экспрессии генов, связанных с апоптозом, что приводит к замедлению скорости роста раковых клеткок , таким образом, приводя к замедления прогрессирования рака. [3] Другие механизмы могут включать деятельность HDIs для де-дифференцировки клеток, обнаруженных в опухолях. HDIs могут иметь несколько эффектов и на негистоновые эффекторные молекулы, так что механизмы противоракового действия еще не ясны. TSA ингибирует HDACs (1, 3, 4, 6 и 10) со значением IC50 около 20 нМ. [4] TSA подавляет ИЛ (ИЛ)-1β / LPS (липополисахарид) / IFN gamma (интерферон γ) индуцированную экспрессию фермента синтазы окиси азота (NOS)2 в мышиных макрофагагоподобных клетках, но увеличивает LPS-стимулированную экспрессию NOS2 в мышиных N9 и первичных клетках микроглии крыс. [5] TSA обладает тератогенными свойствами и потенциально может использоваться в стимуляции регенерации и восстановления дистрофических мышц, тем самым противодействуя прогрессирование заболевания, что продемонстрировано на двух разных мышиных моделях мышечной дистрофии. Трихостатин А (TSA), в эксперименте регенерирует мышечную ткань [6] и способствует растворению камней в почках, снижая уровень кальция и магния в моче. [7] TSA не был проверен в клинических испытаниях по состоянию на 2013-05-27. [8]

Трихостатин А — противогрибковый антибиотик, который является эффективным и специфическим ингибитором гистондезацетилазы (HDAC) клеток млекопитающих, как в естественных условиях, так и в пробирке. ТСА ингибирует клеточный цикл эукариотической клетки и индуцирует обратимую трансформацию клеток. Блокирует деление клетки в фазе G1 (показано для клеток HeLa).

Содержание

  • 1 Содержание
  • 2 См. также
  • 3 Примечания
  • 4 Литература

Содержание [ править ]

Трихостатин А (TSA) является органическим соединением, которое обладает противогрибковой активностью и селективно ингибирует класс I и II семейства ферментов гистондеацетилаз (HDAC) млекопитающих, но не влияет на III класс этих ферментов под названием сиртуины [1] Трихостатин А выделен и очищен из Streptomyces hygroscopicus [en] [2] . TSA ингибирует цикл деления эукариотической клетки в начальной стадии роста. Трихостатин может быть использован для изменения экспрессию генов путем регулирования количества ацетильных групп у ядерных белков — гистонов, ингибируя гидролитические ферменты гистондеацетилазы (HDAC) и облегчая доступ и проникновение факторов транскрипции к молекулам ДНК внутри хроматина. TSA является членом более крупного класса ингибиторов гистондеацетилазы [en] (HDIs или HDACIs), которые имеют широкий спектр эпигенетической деятельности. Считают, что TSA имеет некоторый потенциал в качестве лекарственного средства против рака [3] . Одним из предложенных механизмов является то, что TSA способствует экспрессии генов, связанных с апоптозом, что приводит к замедлению скорости роста раковых клеткок, таким образом, приводя к замедления прогрессирования рака [4] . Динамическое равновесие между ацетилированием и деацетилированием гистонов существенно для нормального роста клеток. Ингибирование гистондеацетилазы приводит к задержке клеточного цикла, клеточной дифференцировке, апоптозу и реверсированию трансформированного фенотипа. Поэтому считается что ингибиторы HDAC могут иметь большой терапевтический потенциал при лечении клеточно-пролиферативных заболеваний или состояний [5] Другие механизмы могут включать деятельность HDIs для дедифференцировки клеток, обнаруженных в опухолях. HDIs могут иметь несколько эффектов и на негистоновые эффекторные молекулы, так что механизмы противоракового действия ещё не ясны. TSA ингибирует HDACs (1, 3, 4, 6 и 10) со значением IC50 около 20 нМ [6] . TSA подавляет ИЛ (ИЛ)-1β / LPS (липополисахарид) / IFN gamma (интерферон γ) индуцированную экспрессию фермента синтазы окиси азота (NOS)2 в мышиных макрофагагоподобных клетках, но увеличивает LPS-стимулированную экспрессию NOS2 в мышиных N9 и первичных клетках микроглии крыс [7] . TSA обладает тератогенными свойствами, но потенциально может использоваться в стимуляции регенерации и восстановления дистрофических мышц, тем самым противодействуя прогрессирование заболевания, что продемонстрировано на разных моделях мышечной дистрофии у мышей. Трихостатин А (TSA) в эксперименте регенерирует мышечную ткань [8] и способствует растворению камней в почках, снижая уровень кальция и магния в моче [9] . Начаты клинические испытания препаратов, на основе TSA. [10]

Читайте также:  Степень разрушения зуба

Трихостатин А — противогрибковый антибиотик, который является эффективным и специфическим ингибитором гистондезацетилазы (HDAC) клеток млекопитающих, как в естественных условиях, так и в пробирке. ТСА ингибирует клеточный цикл эукариотической клетки и индуцирует обратимую трансформацию клеток. Блокирует деление клетки в фазе G1 (показано для клеток HeLa).

Содержание

  • 1 Содержание
  • 2 См. также
  • 3 Примечания
  • 4 Литература

Содержание

Трихостатин А (TSA) является органическим соединением, которое обладает противогрибковой активностью и селективно ингибирует класс I и II семейства ферментов гистондеацетилаз (HDAC) млекопитающих, но не влияет на III класс этих ферментов под названием сиртуины [1] Трихостатин А выделен и очищен из Streptomyces hygroscopicus [en] [2] . TSA ингибирует цикл деления эукариотической клетки в начальной стадии роста. Трихостатин может быть использован для изменения экспрессию генов путём регулирования количества ацетильных групп у ядерных белков — гистонов, ингибируя гидролитические ферменты гистондеацетилазы (HDAC) и облегчая доступ и проникновение факторов транскрипции к молекулам ДНК внутри хроматина. TSA является членом более крупного класса ингибиторов гистондеацетилазы [en] (HDIs или HDACIs), которые имеют широкий спектр эпигенетической деятельности. Считают, что TSA имеет некоторый потенциал в качестве лекарственного средства против рака [3] . Одним из предложенных механизмов является то, что TSA способствует экспрессии генов, связанных с апоптозом, что приводит к замедлению скорости роста раковых клеткок, таким образом, приводя к замедления прогрессирования рака [4] . Динамическое равновесие между ацетилированием и деацетилированием гистонов существенно для нормального роста клеток. Ингибирование гистондеацетилазы приводит к задержке клеточного цикла, клеточной дифференцировке, апоптозу и реверсированию трансформированного фенотипа. Поэтому считается что ингибиторы HDAC могут иметь большой терапевтический потенциал при лечении клеточно-пролиферативных заболеваний или состояний [5] Другие механизмы могут включать деятельность HDIs для дедифференцировки клеток, обнаруженных в опухолях. HDIs могут иметь несколько эффектов и на негистоновые эффекторные молекулы, так что механизмы противоракового действия ещё не ясны. TSA ингибирует HDACs (1, 3, 4, 6 и 10) со значением IC50 около 20 нМ [6] . TSA подавляет ИЛ (ИЛ)-1β / LPS (липополисахарид) / IFN gamma (интерферон γ) индуцированную экспрессию фермента синтазы окиси азота (NOS)2 в мышиных макрофагагоподобных клетках, но увеличивает LPS-стимулированную экспрессию NOS2 в мышиных N9 и первичных клетках микроглии крыс [7] . TSA обладает тератогенными свойствами, но потенциально может использоваться в стимуляции регенерации и восстановления дистрофических мышц, тем самым противодействуя прогрессирование заболевания, что продемонстрировано на разных моделях мышечной дистрофии у мышей. Трихостатин А (TSA) в эксперименте регенерирует мышечную ткань [8] и способствует растворению камней в почках, снижая уровень кальция и магния в моче [9] . Начаты клинические испытания препаратов, на основе TSA. [10]

Ссылка на основную публикацию
Трихопол производитель
Трихопол " /> ТРИХОПОЛ (Trichopol). Фирма-производитель: Polpharma. Международное название: Metronidazole. Коды АТХ: P01AB01. Фармакологическое действие. Противопротозойный препарат. Механизм действия связан...
Трихопол показания к применению цена в казахстане
Инструкция по применению Состав: Показания к применению: Фармакокинетика: Абсорбция - высокая (биодоступность не менее 80%). Обладает высокой проникающей способностью, достигая...
Трихопол при вагините
По данным ВОЗ трихомониаз является наиболее распространенным в мире излечимым заболеванием, передающимся половым путем (WHO, 2007). Клиническая картина трихомониаза, как...
Трихопол пьют до еды или после
Инструкция по применению: Цены в интернет-аптеках: Трихопол (Trichopol) – синтетическое средство с противомикробным и противопротозойным действием, применяемое при лечении тяжелых...
Adblock detector